作者：崔钢华,饶烽,王琰,曹薇薇,刘伟,王维山,史晨辉 单位：吉林大学 出版：《吉林大学学报(医学版)》2015年第06期 页数：7页  （PDF与DOC格式可能不同） PDF编号：PDFBQEB2015060050 DOC编号：DOCBQEB2015060059 下载格式：PDF + Word/doc 文字可复制、可编辑
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    • 目的：构建含有增强型青色荧光蛋白-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)融合蛋白的真核表达载体(ECFP-uPA substrate-linker-YPet)，即uPA的生物传感器。方法：以Src-biosensor为模板，Primer Premier 5.0软件设计YPet引物，设计时5′端引入uPA底物序列及Linker，两端连接酶切位点及保护碱基。以pMDTM-18T为中间载体，通过基因工程方法构建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表达载体。然后转染293T细胞，24h后观察转染效率和融合蛋白表达情况，在荧光显微镜下，应用MetaFlour FRET 4.6软件观察并测量uPA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果：经过PCR和双酶切鉴定，克隆片段和酶切片段均与uPA substrate分子大小相符。细胞转染后转染效率达40%。免疫荧光检测，uPA生物传感器在293T细胞膜表达，用重组人uPA(rhuPA)刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结论：成功构建.....。

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